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杰享第07期:自动化分析淋巴细胞浸润、肿瘤TBs分布及两者空间关系可提高II期结直肠癌预后评估准确性
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背景介绍

肿瘤淋巴结转移(Tumor Node Metastasis,TNM)分期仍然是结直肠癌患者预后分层的金标准,临床基于TNM分期结果选择对应的治疗方法。大部分II期结直肠癌患者在外科手术切除后,不进行辅助治疗的情况下可实现长期的无疾病生存(Disease Free Survival,DFS),但是约20%的患者会出现疾病进展并死亡,另外一些III期患者比某些II期患者的预后更好,说明现有的TNM分期在预后分层方面存在一定的缺陷。尽管对TNM指南进行了修订,例如将pT stage II细分为三类,有助于病理学家进一步细化评估患者肿瘤进展风险,但是预后分层结果仍然是高度主观的。
除了TNM分期,Tumor buds (TBs)也可用于结直肠癌患者的预后评估。TBs是指在肿瘤的侵入性边缘区域(Invasive Margin,IM)散布的小的、分化差的细胞簇(1-4个肿瘤细胞),与结直肠癌的不良预后相关。TNM分期和TBs都只关注肿瘤细胞,但是越来越多的研究表明,肿瘤微环境(Tumor Microenvironment,TME)中的宿主免疫细胞浸润在肿瘤进展中起着至关重要的作用。特别是在大肠癌中,开创性研究表明CD3+、CD8+ T细胞浸润是预测患者生存的独立预后因素。因此免疫细胞和TBs之间的相互作用,可能预测肿瘤转移潜力。过往的研究表明,不仅可以通过自动化定量分析TME中的CD3+、CD8+ T细胞,从而替代主观性大的人工分析,同样,也可以通过自动图像分析来进行TBs分析。尽管免疫细胞肿瘤浸润程度和TBs的自动化定量分析均与患者的预后有关,但是没有同时研究过两种标志物之间的空间关系及其预后价值。
因此,Ines P. Nearchou等在American Association for Cancer Research上发表了文章《Automated Analysis of Lymphocytic Infiltration, Tumor Budding, and Their Spatial Relationship Improves Prognostic Accuracy in Colorectal Cancer》,使用多重免疫组织化学技术,在同一张切片上同时检测多个生物标志物,并基于业内领先的图像分析软件HALO,建立了淋巴细胞浸润程度、TBs在肿瘤中的空间关系自动化定量分析方法,并提高了结直肠癌预后分析的准确性及标准化程度。

文献快读

文章中通过建立基于HALO Next Generation Image Analysis Software的自动化分析流程,同时定量分析淋巴细胞浸润程度、肿瘤TBs密度及两者之间的空间关系,结合来自三个研究队列的II期结直肠癌患者临床数据,实现更准确的结直肠癌预后分析。

一、淋巴细胞浸润分析(Lymphocytic Infiltration Analysis)

如图1所示,HALO软件可自动识别全组织区域(Full Tissue Area,Yellow Line)、肿瘤侵袭边缘(Invasive Front,Green Line),肿瘤侵袭区域(Invasive Margin,IM)包含肿瘤侵袭边缘内外延伸500 μm的区域,肿瘤核心区(Core Area of Tumor,CT)不包含肿瘤侵袭边缘内500 μm之内的区域:


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图1. Full tissue area (yellow line) and invasive front (green line)are outlined; pancytokeratin (PanCK), CD3+, and CD8+ cells annotated in green,yellow, and red, respectively; IM region is highlighted in green and the tumor core region in blue (CT)

如图2所示,同时自动分析CT、IM内的CD3+、CD8+ T细胞浸润程度,通过计算T细胞密度(cells/mm2)来评估预后价值:


图2. Detection and classification of lymphocyte cell type (CD3+ cells in yellow, CD8+ cells in red and their colocalization in orange mask)

二、肿瘤TBs分析(Tumor Budding Analysis)

如图3所示,可自动分析IM内的TBs密度(TBs/mm2 ),进一步评估其预后价值:


图3. Full tissue area (yellow line) and invasive front (green line)are outlined, PanCK, CD3+, and CD8+ cells annotated in green, yellow, and red,respectively; area of TB quantification is highlighted in green

如图4所示,通过自动分析细胞角蛋白(Pancytokeratin,PanCK),可将肿瘤细胞与基质细胞区分开:


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图4. Tumor to stroma segmentation and PanCK cell quantification within the tumor areas

三、淋巴细胞和TBs空间关系分析(Spatial Analysis of Lymphocytes and TBs)

如图5所示,基于HALO软件,可自动分析CD3+、CD8+ T细胞及TBs之间的空间定位关系:

图5. Proximity analysis of lymphocytes to TBs. CD3+ cells are shown in blue, CD8+ cells in orange, and TBs in gray. Proximity line series is shown for lymphocytes within 50 mm of TBs

四、空间关系分析(Statistical analysis)

如图6所示,TBISI指数(Tumor Bud Immuno Spatial Index) 同时分析淋巴细胞浸润、TBs,及两者空间关系,与传统的TNM分期及淋巴细胞浸润、TBs单指标分析,能更准确的提供II期结直肠癌预后分层结果:


图6. Kaplan–Meier survival analysis for pT stage, TB number,lymphocytic infiltration score (LIS), and TBISI for training cohort, validation cohort 1, and validation cohort 2
  1. pT stage for training cohort
  2. pT stage for validation cohort 1
  3. pT stage for validation cohort 2
  4. TB number for training cohort
  5. TB number for validation cohort 1
  6. TB number for validation cohort 2; High represents the group of patients with TB number above the optimal cutoff point (1104.0). Low represents the group of patients with TB number below the cutoff point
  7. LIS for training cohort
  8. LIS for validation cohort 1
  9. LIS for validation cohort 2. High LIS represents the group of patients with a LIS > 2, and low LIS represents the group of patients with a LIS ≤ 2
  10. TBISI for training cohort
  11. TBISI for validation cohort 1
  12. TBISI for validation cohort 2. High risk represents the group of patients who have CD3+density in WTS and mean CD3+ CD8+ cell number within 0–50 mm of TBs below the cutoff point (389.6 cells/mm2 and 4.1, respectively) and TB number above the cutoff point (1104.0). Low risk represents all other patients

杰论

文章中使用多重免疫组化技术(Multiplex Immunohistochemistry,mIHC)来同时检测CD3+、CD8+ T淋巴细胞,以及使用PanCK区分肿瘤细胞及基质细胞,所有生物标志物的检测都在同一张切片上完成的。该技术可以克服常规IHC技术的局限性,仅需要一张组织切片,就可以同时检测多个标志物,并能研究组织细胞组成、细胞功能及细胞间相互作用。在肿瘤免疫治疗领域,这项技术在转化医学研究和临床实践中具有强大的应用潜力。

迈杰转化医学作为国内精准诊断整体解决方案的领导者,致力于解决精准医疗药物研发及患者用药痛点,围绕生物标志物研究、伴随诊断开发,建立了完善的核酸组学、蛋白组学、细胞组学技术平台。在mIHC能力方面,整合了Leica Bond RX、PerkinElmerVectra3 System、HALO三大平台。HALO是应用于数字病理图像分析的旗舰平台,兼容市面上所有主流数字病理扫描平台,提供全组织切片快速、准确的定量分析,对于HE、IHC、IF、ISH/FISH以及特殊染色的定量分析是理想的选择,可以适应任何图像分析应用。为助力药企加快药物研发进展,迈杰转化医学提供下列基于mIHC平台的服务:


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参考文献

1.  Ines P. Nearchou ,etal. Automated Analysis of Lymphocytic Infiltration, Tumor Budding,and Their Spatial Relationship Improves Prognostic Accuracy in Colorectal Cancer. Published Online First March 7, 2019; DOI:10.1158/2326-6066.CIR-18-0377.