图1 全血刺激实验[1]
保留完整细胞组分：保留血液所有细胞成分（红细胞、血小板等）和血清因子，接近体内免疫环境，避免PBMC分离导致的细胞预激活和表型改变。
操作简单快捷：省去耗时的PBMC分离步骤（如密度梯度离心和洗涤），显著缩短实验周期并降低操作误差。
样本需求量少：对儿科患者、小型动物模型（如小鼠）以及需频繁采样的纵向研究尤为重要。
减少细胞损失与异常活化：PBMC分离过程可能造成特定细胞亚群丢失或非特异性激活，相比之下，全血预处理步骤最少，能够更接近生理体内状态。
标准化潜力大：标准化全血刺激系统（如TruCulture）可降低技术变异性，提升多中心研究可重复性。
临床适用性强：可直接用于临床样本分析，适用于大规模人群研究和疫苗效果评估。
1、疫苗免疫原性的快速评价
疫苗的成功，不仅在于诱导中和抗体，更在于能否建立起强大的特异性细胞免疫记忆。全血刺激实验作为一种高效的功能学评估工具，通过使用疫苗抗原（如病毒肽段）刺激疫苗接种者的全血，检测IFN-γ等Th1型细胞因子的释放，从而定量评估 T细胞免疫水平。例如，在新冠疫苗研究中，一种基于全血的干扰素γ释放分析被开发出来，无需分离PBMC即可直接、高效地量化针对SARS-CoV-2棘突蛋白的 CD4+和CD8+ T细胞反应，为大规模评估疫苗诱导的细胞免疫提供了便捷高效的解决方案[2]。
2、感染与免疫缺陷的功能诊断
此外，在先天性免疫缺陷病的功能筛查中，基于全血的多重刺激实验提供了一种高效的全局性评估方案。通过使用LPS（主要激活髓系细胞，如单核/巨噬细胞）、PHA 或SEB（主要激活淋巴系细胞，如T细胞）等特异性刺激物分别刺激同一全血样本，可实现对不同免疫细胞亚群功能的同步、快速评估[1]。
在脓毒症等危重症的复杂病程中，免疫系统经历着从“炎症风暴”到“免疫麻痹”的动态演变。传统的静态炎症指标（如CRP、降钙素原）难以反映免疫细胞的实际功能状态。而全血刺激实验通过评估免疫细胞在特定刺激下的反应能力，实现了对免疫功能状态的动态、功能性监测。
研究者通过LPS刺激脓毒性休克患者的全血，并检测单核/巨噬细胞产生TNF-α的能力，成功量化了患者先天免疫细胞的功能受抑程度，精准识别出处于 “免疫麻痹”状态的个体。这种对免疫功能的精准量化评估，超越了传统炎症指标，为在适当时机对特定患者实施个体化免疫刺激治疗（如使用IFN-γ、 GM-CSF 等）提供了至关重要的决策依据[4]。
通过使用LPS和PHA刺激RA与SpA患者的全血，并检测TNF-α、IL-17等关键促炎细胞因子的释放水平。研究发现，该测定结果与患者的临床疾病活动度具有显著相关性。更重要的是，在接受抗TNF-α药物治疗后，两类患者全血中IL-17等细胞因子的反应性也随之发生改变，这从功能上证实了药物不仅抑制了TNF-α本身，更间接阻断了其下游的炎症网络，这表明该技术能够动态反映药物治疗对免疫通路的功能性抑制效果[5][6]。
1、培养时间有限：通常仅能培养约2天，无法开展长期研究，超过时间后细胞需新营养供应，短寿命免疫细胞（如粒细胞）会丢失。
2、样本处理时间敏感：采血后需数小时内处理，延迟24小时及以上会严重影响结果质量。
3、细胞亚群分析困难：难以精确区分不同免疫细胞亚群的贡献，尤其在复杂刺激条件下。
4、个体差异大：尽管个体内变异较小，但个体间变异显著，影响结果解释。
5、检测灵敏度限制：低丰度细胞因子或稀有细胞群体的反应难以检测。
抗凝剂的选择：肝素是绝大多数全血刺激实验的首选抗凝剂，因为枸橼酸盐或EDTA会通过螯合钙离子，严重抑制T细胞活化等关键信号转导过程，哪种抗凝剂最适合需根据实验目的选择。
全血稀释：全血通常使用无血清用培养基（如RPMI 1640）适当稀释（例如1:2至1:10），以提供营养并降低血浆抑制物浓度，但稀释度需优化，避免破坏生理相关性，可根据实验需求添加抗生素或其他补充剂；TruCulture系统直接使用预装培养基，无需额外稀释步骤。
培养条件与检测：37°C，5% CO₂，可选择使用24孔，48孔，96孔板培养，培养时间根据实验目的调整（一般培养时长为2-48 小时），最长培养时限应≤72 h（避免粒细胞凋亡）。
刺激物的选择（核心环节）：
1）有丝分裂原：如植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA，主要刺激T细胞）和脂多糖（LPS，主要刺激单核/巨噬细胞），用于评估免疫细胞的整体功能潜力。
2）特异性抗原：如纯化蛋白衍生物（PPD，用于结核免疫）、病毒肽段库（如CMV、EBV），用于评估抗原特异性免疫记忆。
3）超抗原：如SEB，能以非特异性方式强力激活大量T细胞。
检测方法选择与操作：
1）上清液中的细胞因子：可通过ELISA、Luminex、MSD等技术检测。
2）细胞表面活化标志物：通过流式细胞术检测，如CD69在T细胞或单核细胞上的早期表达。
如前文所述，全血刺激实验是评估免疫检查点抑制剂药效的关键工具。基于此，迈杰转化医学开发并验证了一套用于评价PD-L1小分子抑制剂药效的IL-2全血释放实验。
本方法的原理在于：在PD-1/PD-L1通路被超抗原激活的前提下，加入PD-L1小分子抑制剂若能有效阻断该通路，则会解除对T细胞的抑制，从而显著提升IL-2的释放水平。
抑制剂以高亲和力竞争性地结合到PD-L1蛋白上，占据其与PD-1相互作用的位点，从而像楔子一样物理阻断PD-L1与PD-1的结合。当PD-1/PD-L1相互作用被抑制剂阻断后，抑制性信号消失。加入超抗原后，在刺激的TCR信号的持续驱动下，全血中T细胞活化程序得以继续，并分泌IL-2。IL-2是T细胞早期活化的核心标志，也是自分泌的生长因子，对T细胞的增殖和功能维持至关重要。其分泌水平直接反映了T细胞的激活状态。因此，IL-2释放量的增加，是T细胞功能“脱抑制”和恢复的最直接、可量化的证据。
实验流程如下：采集健康志愿者全血，将每份样本等分后进行平行处理。两份样本均使用经典超抗原SEB进行刺激，其中一份加入PD-L1小分子抑制剂，另一份作为不加药对照。通过计算“加药样本IL-2浓度”与“不加药样本IL-2浓度”的比值（即IL-2比率），来定量评估药物对免疫通路的阻断效果，比率大于1表明药物起效。
在方法学建立过程中，我们系统优化了关键实验参数。结果显示，与1:2稀释相比，1:10的全血稀释比例能有效降低内源性抑制背景，从而获得更高的IL-2比率。在确定的1:10稀释条件下，更强的刺激（1000 ng/mL SEB）和更长的孵育时间（72小时）共同提供了T细胞活化与细胞因子生成的最佳条件，致使IL-2比率达到峰值（图2）。
图2 不同条件下IL-2比率的变化
在此优化的条件下，进一步进行的剂量反应实验证实，药物的效应呈现良好的浓度依赖性，即随着药物浓度降低，IL-2比率也随之下降（图3）。
此外，方法学验证结果表明，全血样本在4℃与室温下保存72小时后，IL-2比率与基线相比无显著差异，证明了样本具有良好的短期稳定性。
综上所述，本研究成功建立了一套稳定、灵敏且可用于定量评价PD-L1小分子抑制剂功能的全血实验方法，为该类药物的临床前研发与转化研究提供了可靠的工具。
图3 不同药物浓度下IL-2比率的变化
全血刺激实验凭借其高度的生理相关性、操作的便捷性以及信息的丰富性，已成为连接基础免疫研究与临床转化应用不可或缺的桥梁。尽管它在细胞水平的精确定量和机制深究上存在局限，但其在功能性、全局性的免疫状态评估中展现出的高效与真实，使其在精准医疗的多个领域扮演着不可替代的角色。选择全血刺激实验，即是选择了一条更高效、更真实地洞察免疫奥秘的路径。
迈杰转化医学的蛋白/生物分析中心可以提供符合GLP、GCP、GCLP等质量规范的实验室分析检测服务，包括生物标记物、药代(PK)、免疫原性(ADA和NAb)等分析检测。已完成超过150种方法学的开发和验证，涉及临床药物有单克隆抗体、双特异性抗体、抗体片段、ADC、融合蛋白、修饰蛋白、多肽药物、CGT、小分子化药等，服务临床试验超200个。迈杰转化医学的蛋白/生物分析中心拥有完善的质量管理体系、稳定的技术团队、丰富的项目经验，能够提供高质量服务。
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参考文献
[1] Müller S, Kröger C, Schultze JL, Aschenbrenner AC.
Whole blood stimulation
as a tool for studying the human immune system. Eur J Immunol. 2024;54(2):e2350519. doi:10.1002/eji.202350519
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Tan A T, Lim J M E, Le Bert N, et al. Rapid measurement of SARS-CoV-2 spike T cells in whole blood from vaccinated and naturally infected individuals[J]. The Journal of clinical investigation, 2021, 131(17).
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Pai M, Denkinger CM, Kik SV, Rangaka MX, Zwerling A, Oxlade O, et al. Gamma interferon release assays for detection of Mycobacterium tuberculosis infection. Clin Microbiol Rev. 2014 Jan;27(1):3-20.
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Winkler MS, Cajander S, Horn F, et al. Human leucocyte antigen (HLA-DR) gene expression is reduced in sepsis and correlates with impaired TNFα response: A diagnostic tool for immunosuppression? J Transl Med. 2017;15(1):166. DOI: 10.1186/s12967-017-1294-5
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Nesbitt, A., & Fossati, G. (2009). Differential Effects of the Anti-TNF-α Agents in Mediating Inhibition of LPS-and PHA-stimulated Cytokine Production in Whole Blood
Cultures: 1191. Official journal of the American College of Gastroenterology ACG, 104, S441.
[6] Rosine N, Koturan S, Guillemot V, et al. Pos1113 Profiling Of Systemic Immune Responses In Axial Spondyloarthritis Patients Reveals Strikingly Distinct Cellular And Molecular Mechanisms Of Action Of Il-17a Inhibitors And TNF-Blockers[J]. Annals of the Rheumatic Diseases, 2023, 82: 881.
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