杰论 | T细胞分化研究和流式检测-迈杰转化医学

杰论 | T细胞分化研究和流式检测

返回列表 来源：发布日期： 2025.04.18

淋巴细胞是身体免疫反应的主要执行者，一般分类为T细胞、B细胞和NK细胞三类^[3] 。T细胞来源于骨髓中的淋巴样祖细胞，在胚胎发育早期，T细胞的前体干细胞经血流输送到胸腺，在胸腺中分化、发育、成熟，主要参与细胞免疫，其免疫功能主要是抗胞内感染、瘤细胞与异体细胞等；T细胞的分化成熟过程分为三个时期，分别在胸腺和外周血以抗原依赖和抗原不依赖的方式进行。

T细胞双阴性时期，分化早期的T细胞经历原T细胞（Pro-T cell）和前T细胞（Pre-T cell）两个阶段，其既不表达CD4分子，也不表达CD8分子。因为不表达TCR和CD3分子，而不能识别抗原，也不具备任何功能。
双阳时期，随后双阴细胞开始表达TCR β链（β链D-J和V-DJ基因首先重排），然后借助α链基因的重排表达TCRα链前体，共同构成前TCR。促进T细胞进一步分化。并诱导CD8分子和CD4分子基因的活化。T细胞先表达CD8分子，然后是CD4分子，形成双阳T细胞。不能识别抗原，也不具备任何功能。
单阳时期，随后胸腺中双阳T细胞经历二次选择过程，分别是CD4+或者CD8+单阳细胞。这是一类成熟T细胞，同时表达TCR和CD3分子，能够识别抗原，介导免疫应答和免疫调节。T细胞成熟后，就随着血流离开胸腺进入外周免疫器官或外周血。

外周淋巴器官分化过程：TCR分子分为两类，一类称为TCR1，由γ和δ两条肽链组成，在T细胞分化过程中首先表达。外周血中5%~10%的T细胞表达TCR1；另一类称为TCR2，有α和β两条链组成，表达稍晚。外周血中90%-95%的T细胞表达TCR2。

γδ T 细胞：γδ TCR不需与MHC分子结合，不需抗原提呈细胞的提呈，可直接识别并结合抗原分子，不存在Naive和memory状态，只有effector状态。在健康的成人中，γδ T 细胞主要分布于肠道、呼吸道以及泌尿生殖道等黏膜和皮下组织。根据免疫微环境既可促炎也可抗炎，同时具有先天免疫和适应性免疫特点。
αβ T细胞：外周血中成熟的αβ T细胞又分为CD4单阳和CD8单阳细胞。其中CD4 T细胞识别MHCⅡ类分子提呈的抗原肽；CD8 T细胞识别MHC I类分子提呈的抗原肽。T-αβ细胞亚群根据效应记忆分化状态进一步分类，包括干细胞记忆（TSCM）、中央记忆（TCM）、效应记忆（TEM）和效应T细胞（TEFF）。区分这些亚群可以通过CD45RA或CD45RO与CD197和CD95的组合标记进行。激活的T细胞除了表达共刺激分子外，还可能表达共抑制受体如CTLA-4、PD-1、TIGIT和TIM-3。
T细胞分化表型特征：

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A.通过CD45RO和CCR7的表达区分CD4+和CD8+ T细胞记忆群体。TN样细胞（类似幼稚细胞）表现为CD45RO-CCR7+，TCM（中央记忆细胞）为CD45RO+CCR7+，TEM/EFF（效应记忆/效应细胞）为CD45RO+CCR7-。TN和TSCM（干细胞记忆细胞）的区分基于CD197的表达差异。

B. 利用CD45RO、CD62L和CD27的表达区分CD4+和CD8+ T细胞记忆群体。TN样细胞为CD45RO-CD62L+CD27+，TCM细胞为CD45RO+CD62L+CD27+，TEM/EFF细胞为CD45RO+CD62L-CD27+/−。

C. 通过FSC-W/FSC-A, SSC-W/SSC-A图来区分单个细胞，非线性细胞群体中的事件称为双细胞。

D. 通过活性染料排除死细胞干扰。

E. 使用带有不同荧光标签的抗原特异性四聚体分析抗原特异性CD8+ T细胞。

F. 荧光减一（FMO）对照用于确定FL3中CD45RO表达的位置，该对照包含除CD45RO-ECD外的所有抗体。这有助于确定CD45RO+细胞的位置。

分析时，应先排除双细胞、死细胞和自发荧光细胞，使用适当的门控策略。对于低含量亚群分析，如TSCM和抗原特异性T细胞，尤为重要。使用四聚体或五聚体染色可以可视化抗原特异性CD8+ T细胞，双四聚体染色提高分析特异性。进行多参数分析时，还应使用荧光减一（FMO）对照来验证阳性群的界限。正确的流式细胞仪设置和门控策略对于全面表征T细胞亚群至关重要。

一、

Notch 信号通路

在T细胞发育过程中起关键性作用。胸腺基质细胞表达的Notch配体与T细胞前体细胞的Notch（受体）相互作用后，传递的信号以及其他细胞因子和胸腺激素的作用，决定了T细胞的定向分化。

在T细胞发育早期，敲除 Notch1基因后, 胸腺细胞呈现出B细胞谱系的表型，而Notch1基因存在时，胸腺细胞呈现为T细胞谱系的表型。上述研究说明，Notch信号通路是T细胞活下来的必要条件。

而在晚期，Washburn等提出的T细胞发育模型认为, 胸腺细胞在经历pre-TCR阶段时，接受Notch1信号则发育为αβTCR+双阳性细胞；未接受Notch1信号则发育为γδ TCR+细胞。

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二、

药物发现

T细胞抗体类药物在治疗癌症和其他疾病方面显示出了显著的应用潜力。通过重新激活患者的T细胞，增强其对癌细胞的识别和攻击能力来发挥作用。

CD19/CD3双抗：靶向B细胞表面的CD19和T细胞表面CD3。B细胞表面的CD19阳性的癌细胞可以被T细胞识别。Blinatumumab被批准用于治疗复发或难治性淋巴细胞白血病（ALL）。
BCMA/CD3双抗：Teclistamab可以同时靶向BCMA阳性的多发性骨髓瘤细胞和T细胞，激活T细胞来杀死癌细胞。
DLL3/CD3：DLL3在小细胞肺癌SCLC中高表达，Tarlatamab可以靶向DLL3阳性的癌细胞和T细胞，从而激活T细胞攻击癌细胞。

CD3靶点开发现状

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三、

临床应用

CD3单抗常被应用到需要进行免疫抑制的疾病中，如器官移植排斥、Ⅰ型糖尿病等。
CD3双抗常被应用在血液肿瘤中，与双抗类似的CAR-T疗法同样以一个肿瘤相关表面抗原作为靶点，同样利用T-cell Effector的功能。
CD3在实体瘤中的探索。新型双特异性TCR-scFV融合蛋白，将靶向肿瘤抗原的TCR与CD3的免疫效应结构域结合在一起，证实了TCR作为T细胞治疗中的抗原识别元件，能够识别更大范围的潜在肿瘤特异性抗原。
细胞治疗：

CAR‑T细胞治疗后期随访中，绝大多数时间点是常规临床免疫功能检测，部分实验室会增加CD28、CD45RA（和/或CD45RO）、CD197（和/或CD62L）、CD95、CD122等进一步区分功能性亚群，因为发现TN、TSCM和TCM表型与更长的体内持久性和更高的抗肿瘤疗效相关。
获得性免疫缺陷综合症 (AIDS)：

有研究发现，HIV感染者的CD45RO+细胞数有明显增加，即人类感染HIV病毒后，外周血T淋巴细胞亚群发生显著变化，纯真T细胞数目减少，记忆T细胞的数目增加，有助于对HIV破坏人体免疫系统机制的研究。免疫重建过程包括早期的CD4+T记忆细胞迅速恢复、初始 CD4+T 细胞缓慢增长、CD8 激活亚群随着启动治疗时间的延长而逐渐下降至正常水平、功能亚群保持稳定。

四、迈杰医学细胞中心流式平台解决方案

目前，迈杰医学细胞中心可开展的检测类型有免疫分型，受体占位，CARX细胞治疗PK/PD，胞内细胞因子，血清/血浆细胞因子，ADCC，CDC，细胞诱导分化，微小残留等检测。

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流式检测相关问题讨论：

1.如何提高检测灵敏度（试剂，抗原密度，样本量，疾病状态等）

2.血样稳定性如何保证（固定，冻存等）

3.组织样本如何保存（固定等）

4.PBMC与全血区别（血细胞成分不同，分离后细胞丢失影响各细胞亚群的占比；粒细胞，单核，巨噬细胞表面FC受体与药物结合，受体占位药物的饱和浓度问题等）

5.仪器性能如何校准（标准微球，自制质控样本等）

参考文献

[1] Bremer SJ, Glau L, Gehbauer C, Boxnick A, Biermann D, Sachweh JS, Tolosa E, Gieras A. OMIP 073: Analysis of human thymocyte development with a 14-color flow cytometry panel. Cytometry A. 2021 Sep;99(9):875-879.

[2] Pellicci DG, Koay HF, Berzins SP. Thymic development of unconventional T cells: how NKT cells, MAIT cells and γδ T cells emerge. Nat Rev Immunol. 2020 Dec;20(12):756-770.

[3] Gherardin NA, Souter MN, Koay HF, Mangas KM, Seemann T, Stinear TP, Eckle SB, Berzins SP, d'Udekem Y, Konstantinov IE, Fairlie DP, Ritchie DS, Neeson PJ, Pellicci DG, Uldrich AP, McCluskey J, Godfrey DI. Human blood MAIT cell subsets defined using MR1 tetramers. Immunol Cell Biol. 2018 May;96(5):507-525.

[4] Comprehensive Phenotyping of T Cells Using Flow Cytometry

[5] Charlotte M. Mousset, Willemijn Hobo, Rob Woestenenk, Frank Preijers, Harry Dolstra, Anniek B. van der Waart

[6] 免疫学原理（第四版）

[7] 中国中西医结合学会检验医学专业委员会. 流式细胞术在嵌合抗原受体‑T细胞免疫治疗相关检验中的应用专家共识[J]. 中华检验医学杂志, 2022, 45(8): 790-801. DOI: 10.3760/cma. j.cn114452-20220218-00081.

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